Афінна хроматографія

Афінна хроматографія – це метод виділення біомолекул з суміші, з використанням високоспецифічних макромолекулярних взаємодій зв’язування між біомолекул і субстратом.

Вибір конкретного типу зв’язування залежить від біомолекули, яку планується виділити. Це може бути антиген і антитіло, аналоговий субстрат і ензим, рецептор і ліганд і так далі. Цей метод часто використовується для ізоляції різних біомолекул. Афінна хроматографія цікава високою чутливістю і здатністю поділу, в порівнянні з іншими хроматографічними методами.

Афінна хроматографія базується на взаємодіях зв’язування між аналітом (найчастіше, розчиненим у рухомій фазі) і зв’язуючим субстратом або лігандом (найчастіше, зафіксованим в стаціонарній фазі). У стандартному експерименті з використанням афінної хроматографії ліганд приєднується до твердої, нерозчинної матриці, найчастіше – полімеру, такого як агароза або поліакриламід, який хімічно модифікований таким чином, щоб надавати для взаємодії з аналітом реактивні функціональні групи, з якими аналіт може реагувати, формуючи стабільні ковалентні зв’язки. Стаціонарна фаза завантажується в хроматографічну колонку, через яку потім проходить мобільна фаза. Молекули, що зв’язалися з лігандом залишаються пов’язаними зі стаціонарної фазою. Потім промивний буфер використовується для того, щоб змити неспецифічно зв’язані молекули, шляхом руйнування їх слабших неспецифічних зв’язків зі стаціонарної фазою, в той час як досліджувана речовина залишається пов’язана з нерухомою фазою. Після цього відбувається відмивання таргетних біомолекул з субстрату, для чого використовується буфер елюції, який руйнує зв’язки між шуканим речовиною і субстратом. Змиті бімолекули потім збираються після елюції і використовуються в подальших дослідженнях.

Для афінної хроматографії не потрібно знати ні молекулярний вагу, ні заряд ні гідрофобність / гідрофільність ні інші фізичні властивості аналіту, досить лише інформації про те, з чим він здатний зв’язуватися, щоб створити протокол сепарації.

Існує ряд відомих пар ліганд-аналіт, для яких можна проводити афінну хроматографію: субстрат або аналог субстрату – ензим, антитіло – антиген, гормон – рецептор, нуклеїнова кислота – нуклеїнова кислота з комплементарної послідовністю нуклеобаз, іони металів – полі-гистидинового протеїн, лектин – полісахарид і т.д.

У загальних рисах, при афінної хроматографії проводиться три етапи очищення:

  1. На нерухому фазу наноситься рухома фаза, після чого відбувається зв’язування молекул аналіту і ліганда.
  2. Відмивний буфер видаляє надлишки не пов’язаного аналіту, неспецифічно зв’язаної речовини, залишаючи на нерухомій фазі лише комплекси ліганд-аналіт.
  3. Буфер елюції прокачується через колонку з твердою фазою, змиваючи з неї аналіт, шляхом руйнування його зв’язків з лігандом.

Проте, існує велика кількість модифікацій цього процесу. Аналіт може прокачуватися через колонку з лігандом знизу-вгору, зверху-вниз, його можна подавати під тиском, з різною швидкістю і різною потужністю потоку. Елюція може проводитися не тільки за рахунок хімічних взаємодій буфера елюції з пов’язаною речовиною, але і за рахунок зміни умов, в яких знаходиться шукана біомолекул: можна змінити рН, температуру, заряд, іонну силу і ще цілий ряд параметрів.

Крім того, сама конструкція установки може змінюватися в залежності від завдань: існують схеми, що використовують кілька колонок послідовно, з різними сорбентами і буферами.

Top
ukUkrainian
en_GBEnglish ukUkrainian