Гель-електрофорез ДНК

Гель-електрофорез ДНК – fналітичний метод, застосовуваний для поділу суміші молекул ДНК і РНК за розмірами і реактивністю.

Основа методу – переміщення молекул нуклеїнових кислот у в’язкому середовищі під впливом електричного поля. ДНК має слабкий негативний заряд, який обумовлений хімічною будовою складових її елементів, а саме, сахарофосфатного остова. Оскільки ДНК – полімер, то сумарний заряд молекули буде залежати від кількості її елементів, тобто довжини. Отже, під впливом електричного поля ДНК різної довжини за один і той ж час проходять різну відстань, бо сила дії електричного поля на заряджене тіло залежить від величини заряду тіла. ДНК, маючи негативний заряд, буде рухатися від катода до анода, причому, в в’язкому середовищі коротші молекули рухаються швидше, ніж довші. Таким чином, за один і той же час, короткі ДНК виявляються ближче до анода, ніж довгі.

Перед використанням цього методу ДНК потрібно підготувати. Найчастіше, довгі ДНК ріжуться на більш короткі фрагменти з використанням ДНК-рестріктази. Крім того, якщо в суміші присутні ферменти (наприклад, після ампліфікації зразка), то їх потрібно видалити перед початком гель-електрофорезу. Після того як всі етапи підготовки пройдені, ДНК у вигляді розчину поміщається в лунки, розташовані на одній стороні гелю, потім до нього приєднується джерело живлення, і створюється напруга, яка підтримується певний проміжок часу.

Сам гель, при цьому, знаходиться в електродної камері, що омивається буфером, який проводить електричний струм. У цьому середовищі ДНК починає під впливом електричного поля мігрувати по гелю в напрямку від катода до анода. Після закінчення відведеного часу напруга відключається і гель аналізується на предмет того, як далеко пішли фрагменти ДНК по довжині гелю. Чим нижче напруга і довше час проведення, тим точніше отримані результати. Крім того, поділ довгих фрагментів ДНК вимагає більш протяжних гелів.

Крім зразка на гель наноситься барвник, найчастіше інтеркалюючий агент, який флуоресціює в УФ-діапазоні. У разі ДНК таким, найчастіше, є бромистий етидій, хоча існує і ряд інших, менш небезпечних для використання барвників. Після завершення електрофорезу, гель поміщається на ультрафіолетовий трансілюминатор. Далі проводиться візуальна оцінка поділу ДНК (з використанням захисних окулярів). В УФ-діапазоні гель слабо флуоресціює синювато-фіолетовим кольором, в той час як ДНК на ньому видно у вигляді яскравих колірних смуг темно-фіолетового, білого, синюватого або оранжевого кольору – в залежності від обраного для проведення досвіду барвника.

В окрему лунку наноситься так звана «молекулярна лінійка» або «леддер». Леддер є заздалегідь синтезована суміш фрагментів ДНК з відомими і точно певними довжинами фрагмента. Таким чином при проведенні електрофорезу, леддерна суміш «розгортається» по довжині гелю у вигляді набору горизонтальних смуг, кожна з яких складається з ДНК відомої довжини. Порівнюючи відносне розташування леддера і досліджуваного зразка, можна визначити, якого саме розміру фрагменти становили досліджувану суміш ДНК.

Гель-електрофорез є одним із стандартних, широко поширених, зручних і досить швидких і точних методів вивчення складу сумішей ДНК, пошуку фрагментів певної довжини і з’ясування розмірів таргетних послідовностей.

До його недоліків можна віднести досить високу канцерогенність барвників і деяку трудомісткість необхідну при маніпуляції з крихкими і тонкими гелями.

Top
ukUkrainian
en_GBEnglish ukUkrainian